Base structurelle de la signalisation hormonale FGF

Jun 18, 2023

Nature (2023)Citer cet article

2 Altmétrique

Détails des métriques

Les corécepteurs α/βKlotho engagent simultanément les hormones du facteur de croissance des fibroblastes (FGF) (FGF19, FGF21 et FGF23)1,2 et leurs récepteurs FGF de surface cellulaire apparentés (FGFR1-4) stabilisant ainsi le complexe endocrinien FGF-FGFR3,4,5,6 . Cependant, ces hormones nécessitent toujours un protéoglycane d'héparane sulfate (HS) en tant que corécepteur supplémentaire pour induire la dimérisation/activation du FGFR et donc déclencher leurs activités métaboliques essentielles6. Pour révéler le mécanisme moléculaire qui sous-tend le rôle de corécepteur de HS, nous avons résolu les structures de cryo-microscopie électronique de trois complexes quaternaires distincts 1: 2: 1: 1 FGF23 – FGFR – αKlotho – HS comportant les isoformes d'épissage 'c' de FGFR1 (FGFR1c) , FGFR3 (FGFR3c) ou FGFR4 en tant que composant récepteur. Ces structures, soutenues par des expériences de complémentation et d'hétérodimérisation des récepteurs à base cellulaire, révèlent qu'une seule chaîne HS permet au FGF23 et à son FGFR primaire dans un complexe ternaire 1: 1: 1 FGF23 – FGFR – αKlotho de recruter conjointement une molécule FGFR secondaire isolée conduisant à dimérisation et activation des récepteurs asymétriques. Cependant, αKlotho ne participe pas directement au recrutement du récepteur secondaire/dimérisation. Nous montrons également que le mode asymétrique de dimérisation des récepteurs est applicable aux FGF paracrines qui signalent uniquement de manière HS-dépendante. Nos données structurelles et biochimiques renversent le paradigme actuel de dimérisation symétrique du FGFR et fournissent des plans pour la découverte rationnelle de modulateurs de la signalisation FGF2 comme thérapeutiques pour les maladies métaboliques humaines et le cancer.

La famille des facteurs de croissance des fibroblastes de mammifères (FGF) comprend 18 polypeptides contenant un domaine d'homologie en trèfle β organisés en cinq sous-familles paracrines et une sous-famille endocrinienne7. Les sous-familles paracrines régissent plusieurs événements au cours du développement embryonnaire8, tandis que les membres de la sous-famille endocrinienne (FGF19, FGF21 et FGF23) sont des hormones qui régulent l'homéostasie des acides biliaires, des lipides, du glucose, de la vitamine D et des ions minéraux1,4,9,10. Les hormones FGF sont des cibles prometteuses pour le traitement d'un éventail de maladies métaboliques, notamment le diabète de type II, l'obésité, la stéatohépatite non alcoolique, la cirrhose biliaire primitive, la diarrhée des acides biliaires, les troubles rénaux de perte de phosphate et les maladies rénales chroniques2,11,12,13, 14,15,16,17,18,19. Les FGF médient leurs actions en se liant, en se dimérisant et en activant ainsi les récepteurs tyrosine kinases transmembranaires FGF à passage unique (FGFR1–4)20,21. La région extracellulaire d'un FGFR prototypique contient trois domaines de type immunoglobuline (Ig) (D1, D2 et D3). D2, D3 et le lieur court D2 – D3 sont nécessaires et suffisants pour la liaison du ligand et la dimérisation du récepteur. Dans FGFR1 – FGFR3, l'épissage alternatif de deux exons mutuellement exclusifs (appelés «b» et «c») modifie la composition des principaux sites de liaison de ligand dans les domaines D3 de ces trois FGFR, augmentant ainsi le nombre d'isoformes principales de FGFR à sept. (c'est-à-dire FGFR1b–3b, FGFR1c–3c et FGFR4)22,23,24.

Les FGF paracrines dépendent des glycosaminoglycanes de sulfate d'héparane (HS) en tant que corécepteur obligatoire pour se lier et dimériser de manière stable leurs FGFR apparentés. Les HS sont des chaînes glycanniques linéaires de protéoglycanes HS (HSPG) qui sont abondamment exprimées dans la matrice extracellulaire de tous les tissus25. Selon la structure cristalline du dimère 2: 2: 2 FGF2 – FGFR1c – HS, HS engage simultanément les sites de liaison HS du FGF paracrine et du FGFR, renforçant ainsi la proximité FGF – FGFR. Ce faisant, HS (1) améliore l'affinité de liaison 1: 1 FG – FGFR; et (2) renforce les interactions entre deux complexes 1:1 pour donner naissance à des dimères 2:2 symétriques doubles26. La dimérisation extracellulaire du FGFR favorise la formation d'un complexe asymétrique thermodynamiquement faible des domaines kinase intracellulaires qui médie la transphosphorylation de la tyrosine en boucle (A) et donc l'activation de la kinase et la signalisation intracellulaire.

Les sites de liaison HS des hormones FGF divergent à la fois sur le plan de la composition et de la conformation de ceux des FGF paracrines, affaiblissant considérablement leur affinité pour HS28. Par conséquent, les hormones FGF évitent le piégeage par les HSPG dans la matrice extracellulaire et peuvent entrer dans la circulation. De plus, les hormones FGF ont une faible affinité pour les FGFR28,29 en raison de substitutions de leurs résidus de liaison aux récepteurs clés. Bien que ces idiosyncrasies structurelles et biochimiques confèrent un mode d'action hormonal, elles rendent le HS insuffisant pour que le FGF endocrinien se lie au FGFR et induise la dimérisation des récepteurs. En effet, pour pallier ces déficiences, les hormones FGF ont développé une dépendance absolue vis-à-vis de αKlotho ou βKlotho en tant que corécepteur supplémentaire pour la signalisation. α- et βKlotho sont des protéines transmembranaires à passage unique avec un grand domaine extracellulaire comprenant deux domaines de type glycosidase en tandem (KL1 et KL2) et un court domaine intracellulaire3,5. Le corécepteur αKlotho (ou βKlotho) se lie simultanément à l'hormone FGF et à son FGFR apparenté, renforçant ainsi la liaison du FGF endocrinien au FGFR. Les corécepteurs de Klotho ont des spécificités uniques de liaison à l'hormone FGF et au FGFR qui dictent finalement la spécificité de liaison au FGFR et la sélectivité des tissus/organes cibles des FGF endocriniens. αKlotho se lie exclusivement au FGF23 (réf. 30) tandis que βKlotho se lie à la fois au FGF19 et au FGF21 (réf. 31, 32, 33, 34). En ce qui concerne l'interaction FGFR, αKlotho et βKlotho montrent une spécificité partagée pour FGFR1c et FGFR4 mais aucun ne reconnaît les isoformes d'épissage «b» de FGFR1–3. Cependant, ils présentent une spécificité opposée envers FGFR2c et FGFR3c avec αKlotho liant FGFR3c mais pas FGFR2c, tandis que βKlotho lie FGFR2c mais pas FGFR3c (réf. 35).

Le mécanisme du corécepteur de l'αKlotho dans la signalisation du FGF23 a été éclairé par la structure cristalline d'un complexe ternaire comprenant le FGF23, le domaine de liaison au ligand FGFR1c6 et l'ectodomaine soluble de l'αKlotho (une isoforme naturelle produite par l'élimination de la forme transmembranaire)36,37. Dans la structure, la longue boucle α1β1 (appelée bras de liaison au récepteur (RBA)) s'étend du domaine KL2 de αKlotho et enserre un sillon hydrophobe dans le domaine D3 de FGFR (une caractéristique conservée de FGFR1c – 3c et FGFR4), tandis qu'un grand la fente à la jonction entre KL1 et KL2 embrasse la longue queue en C de FGF23. Ce faisant, αKlotho renforce la proximité FGF23-FGFR et la stabilité complexe. En ce qui concerne le rôle de HS, nous avons précédemment postulé que HS permet à deux complexes 1: 1: 1 FGF23 – FGFR – αKlotho de s'assembler en une unité de signalisation quaternaire symétrique 2: 2: 2: 2 FGF23 – FGFR – αKlotho – HS rappelant 2 :2:2 dimères paracrine FGF–FGFR–HS6. Pour établir le mécanisme sous-jacent à la dimérisation / activation du FGFR dépendant du double corécepteur (c'est-à-dire αKlotho et HS) par les hormones FGF, nous avons résolu les structures de microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) des trois complexes quaternaires FGF23 – FGFR – αKlotho – HS physiologiquement possibles. De manière inattendue, ces structures, étayées par des données cellulaires complètes, révèlent que HS renforce les interactions du FGF23 et de son FGFR primaire dans un FGF23 – FGFR – αKlotho 1: 1: 1 avec un FGFR solitaire secondaire, induisant ainsi une dimérisation et une activation asymétriques des récepteurs. Notamment, le mode asymétrique de dimérisation des récepteurs est généralisable aux FGF paracrines, ce qui renverse ainsi notre modèle symétrique actuel de dimérisation et d'activation des FGFR26.

Nous avons préparé des mélanges quaternaires 1: 1: 1: 1 de FGF23 humain mature pleine longueur, les parties extracellulaires de liaison au ligand (c'est-à-dire englobant les domaines D2 et D3) de trois FGFR apparentés humains de FGF23 (c'est-à-dire FGFR1c, FGFR3c et FGFR4), l'ectodomaine entier du corécepteur αKlotho humain et un dodécasaccharide d'héparine entièrement sulfaté (ci-après dénommé HS). Les trois complexes quaternaires résultants (c'est-à-dire FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS, FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS et FGF23–FGFR4–αKlotho–HS) ont été isolés par chromatographie d'exclusion stérique (SEC) et ont été utilisés directement pour la vitrification, collecte d'images cryo-EM et détermination de la structure (données étendues Fig. 1, tableau de données étendu 1 et Fig. 2 supplémentaire). Contrairement à nos prédictions, les trois structures cryo-EM révèlent des assemblages quaternaires asymétriques identiques 1: 2: 1: 1 FGF23 – FGFR – αKlotho – HS dans lesquels HS permet à un complexe ternaire 1: 1: 1 FGF23 – FGFR – αKlotho de recruter un chaîne FGFR isolée (appelée FGFRS pour la différencier du récepteur "primaire" FGFRP au sein du complexe ternaire) (Fig. 1). À l'extrémité distale de la membrane de chaque complexe quaternaire, HS s'engage dans des interactions tripartites avec des sites de liaison HS juxtaposés de FGF23, FGFRP et FGFRS (Fig. 2a). Ce faisant, HS augmente les interactions du FGF23 et du FGFRP du complexe ternaire FGF23 – FGFRP – αKlotho avec la chaîne FGFRS, et induit ainsi la dimérisation du récepteur (c'est-à-dire FGFRP – FGFRS) (Fig. 3a). Notamment, la proximité et l'orientation (perpendiculaires à la membrane plasmique) des extrémités C-terminales des chaînes FGFR (à environ 25 Å d'écart) acquiescent à la formation d'un dimère asymétrique transphosphorylant à boucle A du domaine kinase intracellulaire 27 (Extended Data Fig. 2a). Bien que αKlotho n'engage pas directement le FGFRS, il préside au recrutement du FGFRS en stabilisant le complexe FGF23-FGFRP. Sans l'aide d'αKlotho, HS ne peut pas générer indépendamment un complexe FGF23-FGFRP stable qui est nécessaire pour recruter un FGFRS secondaire. En effet, des expériences cellulaires confirment que la signalisation du FGF23 est strictement dépendante de αKlotho (Extended Data Fig. 2b). La conformation du complexe ternaire FGF23 – FGFRP – αKlotho au sein des assemblages quaternaires 1: 2: 1: 1 FGF23 – FGFR – αKlotho – HS est similaire à celle de la structure aux rayons X du complexe ternaire FGF23 – FGFR – αKlotho sans HS (écart quadratique moyen (RMSD) de seulement 1,16 Å, données étendues Fig. 2c)6. Cependant, le composant FGFRS du complexe quaternaire adopte une conformation déformée incompatible avec la liaison au ligand, ce qui explique ainsi l'asymétrie distincte du complexe quaternaire (Fig. 4 supplémentaire).

Vue d'ensemble des reconstructions cryo-EM des complexes quaternaires FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS (a), FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS (b) et FGF23–FGFR4–αKlotho–HS (c) affichés à des seuils de 0,6, 0,45 et 0,5, respectivement. Le complexe quaternaire est représenté dans deux orientations différentes liées par une rotation de 180° le long de l'axe vertical. FGF23 est coloré en orange, αKlotho est représenté en bleu foncé et HS est en magenta. Le récepteur primaire (FGFRP) et le récepteur secondaire (FGFRS) sont représentés en vert et bleu clair dans le complexe FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS, en beige et rose dans le complexe FGF23-FGFR3c-αKlotho-HS et en or et jaune clair dans le complexe FGF23–FGFR4–αKlotho–HS. Deux domaines de type glycosidase en tandem (KL1 et KL2) et RBA de αKlotho sont marqués. La pertinence de la densité extra faible (en gris) observée dans les trois complexes quaternaires 1: 2: 1: 1 est discutée dans la Fig. 3 supplémentaire.

a, complexe quaternaire asymétrique FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS présenté comme un hybride de dessin animé (FGF23, FGFR et HS) et de surface (αKlotho) dans la même orientation que sur la Fig. 1a (à gauche). b, vue agrandie de la région encadrée dans le panneau a montrant l'interaction tripartite de HS avec FGF23, FGFRP et FGFRS. Les résidus d'interaction HS sont représentés sous forme de bâtonnets et étiquetés. Les liaisons hydrogène dans cette figure et les figures suivantes sont représentées par des lignes pointillées noires. Sur toutes les figures, les atomes d'azote, d'oxygène et de soufre sont respectivement colorés en bleu, rouge et jaune. Toutes les illustrations structurelles ont été réalisées à l'aide de Pymol (v.2.5.2). c, L6-FGFR1cWT, L6-FGFR1cΔHBS1, L6-FGFR1cΔHBS1 ou L6-FGFR1cΔHBS1+2 ont été cotraités avec 20 nM de mélange 1:1 de FGF23WT + αKlotho ou FGF23R48A/R140A (FGF23ΔHBS) + αKlotho (dans le cas de L6- FGFR1cWT uniquement ) ou laissé sans traitement. Les lysats cellulaires totaux ont été immunotransférés avec un anticorps anti-pY656/Y657-FGFR, anti-pY783-PLCγ1, anti-pY196-FRS2α, anti-pT202/Y204-ERK et anti-β-tubuline (contrôle de charge). d, Perte des capacités des mutants FGF23ΔHBS et FGFR1cΔHBS à induire la formation du complexe quaternaire FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS tel que visualisé par PLA. Les taches rouges signifient les complexes quaternaires FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS sur la surface cellulaire et les grands cercles / ovales colorés en bleu sont les noyaux cellulaires. Notez que, par rapport aux cellules L6-FGFR1cWT traitées au FGF23WT, il y a beaucoup moins de taches rouges dans les cellules L6-FGFRcWT traitées au FGF23ΔHBS et L6-FGFR1cΔHBS traitées au FGF23WT. Barre d'échelle, 10 μm. L'immunotransfert (c, normalisé par rapport aux FGFR1 et FGF23 de type sauvage, n = 3 expériences biologiquement indépendantes) et le PLA (d, n = 6 champs de microscope choisis au hasard à partir de deux expériences biologiquement indépendantes) ont été quantifiés comme décrit dans la section Méthodes et sont présentés comme la moyenne ± écart-type. Les valeurs P ont été déterminées par ANOVA à deux voies suivie du test post hoc de comparaisons multiples de Tukey.

Données source

a, Représentation de la structure du complexe FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS sous la forme d'un mélange de dessin animé (FGF23 et FGFR) et de surface (αKlotho). La vue est liée à celle de la Fig. 1a (à droite) par une rotation de 90° le long de l'axe vertical. Les sites de contact 1 et 2 de l'interface dimère FGFR1cP – FGFR1cS sont respectivement encadrés en bleu et noir. A noter que αKlotho ne participe pas directement au recrutement du FGFR1S. A gauche, vue agrandie du site 1 impliquant le domaine D2 de FGFR1cP et D2, le lieur D2-D3 et D3 de FGFR1cS. A droite, vue rapprochée du site 2 entre les domaines D3 de FGFR1cP et FGFR1cS. Les chaînes latérales des résidus en interaction sont représentées sous forme de bâtonnets. Les éléments de structure secondaires sélectionnés sont étiquetés. Les contacts hydrophobes sont mis en évidence comme une surface semi-transparente. Un ion Cu2+ (sphère orange) est coordonné par des résidus histidine analogues de FGFR1cP et FGFR1cS. L'attribution de Cu2+ était basée sur une publication précédente impliquant des interactions spécifiques de Cu2+ avec des domaines extracellulaires de FGFR39. Les ions Cu2+ proviennent probablement de milieux de culture cellulaire (DMEM et DME/F12) utilisés pour faire pousser des cellules HEK293S GnTI− qui sécrètent des ectodomaines FGFR peu glycosylés. b – d, analyses par immunotransfert d'extraits de cellules entières sondées comme sur la figure 2c à partir de lignées cellulaires L6 non stimulées ou costimulées par FGF23 (20 nM) et αKlotho (20 nM) FGFR1c (b), FGFR3c (c) ou FGFR4 (d). Les données d'immunoblot ont été quantifiées comme décrit dans la section Méthodes et sont présentées sous forme de moyenne ± écart type. Données normalisées par rapport au FGFR de type sauvage et au FGF23, n = 3 expériences biologiquement indépendantes. Les valeurs P ont été déterminées par ANOVA à deux voies suivie du test post hoc de comparaisons multiples de Tukey.

Données source

Les interactions FGF23 – HS sont médiées par trois résidus (Arg48, Arg140 et Tyr154) du site de liaison HS atypique au sein du noyau de FGF23 (Fig. 2b). Comparé aux contacts FGF23 – HS, HS interagit plus largement avec HBS dans les domaines D2 des deux chaînes FGFR, impliquant les résidus Lys177, Lys207, Arg209 et Ser214 de FGFR1cP et Lys175, Lys177, Val208, Arg209 et Thr212 de FGFR1cS (Fig. 2b ). Pour valider l'importance physiologique des interactions à trois voies de HS avec FGF23, FGFR1cP et FGFR1cS pour l'induction de la dimérisation des récepteurs (c'est-à-dire FGFRP-FGFRS), nous avons introduit une double mutation R48A/R140A dans FGF23 (FGF23ΔHBS) et K175Q/K177Q et les doubles mutations K207Q/R209Q (FGFR1cΔHBS1 et FGFR1cΔHBS2) séparément ou en combinaison (K175Q/K177Q/K207Q/R209Q appelées FGFR1cΔHBS1+2) dans le FGFR1c complet. Le FGFR1c de type sauvage (FGFR1cWT) et ses variants mutés ont été exprimés de manière stable à la surface de cellules myoblastiques squelettiques de rat (L6), une lignée cellulaire déficiente en αKlotho et FGFR. Le traitement à l'endoglycosidase H (Endo H) et à la peptide:N-glycosidase F (PNGase F) des lysats cellulaires suivi d'une analyse par immunotransfert avec des anticorps spécifiques au FGFR a montré que les variants mutés du FGFR1c contiennent des sucres complexes, ce qui implique qu'ils résident à la surface de la cellule (Extended Données Fig. 3a). L'homogénéité / quantité égale des échantillons de FGF23WT et de FGF23ΔHBS a été vérifiée par SDS – PAGE (Fig. 2d supplémentaire). Le cotraitement avec le FGF23WT et l'αKlotho soluble de L6-FGFR1cWT a conduit à une activation/signalisation robuste du FGFR1c, mesurée par la phosphorylation du FGFR1c sur les tyrosines à boucle A, ses deux substrats directs PLCγ1 (sur le régulateur Y783) et FRS2α (sur le site de recrutement Grb2 Y196) et l'activation ultérieure d'une voie RAS – protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) telle que surveillée par la phosphorylation de la kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK) sur T202 / Y204. En revanche, les doubles mutants FGFR1cΔHBS1 et FGFR1cΔHBS2 ont subi des pertes importantes dans leur capacité à induire la signalisation FGF23, et le quadruple mutant FGFR1cΔHBS1 + 2 est devenu totalement silencieux (Fig. 2c). De même, FGF23ΔHBS a été significativement retardé dans sa capacité à activer L6-FGFR1cWT en présence d'αKlotho soluble. Les données d'activation/signalisation du FGFR ont été reflétées par les données du test de ligature de proximité (PLA). Plus précisément, le cotraitement avec FGF23WT et αKlotho a conduit à l'apparition de signaux fluorescents ponctués copieux et intenses à la surface de la lignée cellulaire L6-FGFR1cWT. En revanche, il y avait beaucoup moins de signaux fluorescents à la surface des lignées cellulaires FGFR1cΔHBS1, FGFR1cΔHBS2 et FGFR1cΔHBS1 + 2 lors du co-traitement. De même, nettement moins de points fluorescents étaient présents à la surface de la lignée cellulaire L6-FGFR1cWT lorsqu'elle était cotraitée avec FGF23ΔHBS et αKlotho soluble (Fig. 2d). Ces données cellulaires confirment le caractère indispensable des contacts FGF23 – HS et FGFR1c – HS pour induire la formation d'un complexe de signalisation de surface cellulaire quaternaire FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS. Conformément à la stoechiométrie 1: 2: 1: 1 FGF23 – FGFR – αKlotho – HS dans les structures cryo-EM, des expériences de chromatographie d'exclusion de taille – diffusion de la lumière sous plusieurs angles ont montré que le complexe quaternaire FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS migre comme une seule espèce avec une masse moléculaire calculée d'environ 220 kDa, ce qui correspond étroitement à la valeur théorique d'un FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS 1: 2: 1: 1 (215 kDa) (Fig. 2e supplémentaire).

Les trois sous-domaines (c'est-à-dire D2, lieur D2 – D3 et D3) des chaînes FGFRP et FGFRS participent au recrutement de FGFRS dans le complexe ternaire et donc à la promotion de la dimérisation des récepteurs (Fig. 3a). Les contacts directs FGFRP-FGFRS enterrent une modeste surface exposée au solvant (1542,6 Å2) et sont préservés parmi les trois structures cryo-EM. L'interface FGFRP–FGFRS peut être divisée en deux sites (c'est-à-dire les sites 1 et 2). Au site 1, les résidus des régions de boucle discontinues (c'est-à-dire les boucles βA '–βB et βE – βF) au coin inférieur (C-terminal) de D2 du FGFRP se tassent de manière asymétrique contre D2, le lieur D2 – D3 et D3 du FGFRS (Fig. 3a). Au site 2, une étendue contiguë de résidus englobant le lieur D2 – D3, le brin βA, la boucle βA – βA 'et le brin βB' de D3, engage la région correspondante du récepteur secondaire de manière pseudo-symétrique (Fig. 3a et Supplémentaire Tableau 1). Notamment, l'interface FGFRP – FGFRS piège deux résidus cruciaux de liaison au ligand du FGFRS, à savoir Arg250 et Ser346, qui privent davantage le FGFRS de la liaison au ligand (Fig. 4b supplémentaire).

Nous avons ciblé le site 2 de l'interface FGFRP-FGFRS dans chacun des trois complexes quaternaires en introduisant quatre mutations ponctuelles différentes individuellement dans FGFR1c pleine longueur (E249A, R254A, I256A, Y280A), FGFR3c (E247A, R252A, I254A, Y278A) ou FGFR4 (E243A, R248A, I250A, Y274A). De plus, nous avons introduit une triple mutation A170D / A171D / S219K dans FGFR1c pour cibler le site 1 de l'interface dimère FGFR1cP – FGFR1cS (Fig. 3a) en tant que représentant des trois complexes quaternaires. Les variants FGFR1c, FGFR3c et FGFR4 de pleine longueur ainsi que leurs homologues de type sauvage ont été exprimés de manière stable dans les cellules L6. Comme ci-dessus, la sensibilité Endo H a été utilisée pour s'assurer que les mutations n'affectent pas la glycosylation / maturation du récepteur et la présentation de la surface cellulaire (données étendues Fig. 3b – d). Hormis le FGFR1cI256A et son mutant FGFR4I250A correspondant, tous les mutants présentaient des rapports comparables entre les FGFR de type sauvage résistants à l'Endo H et les FGFR totaux de type protéine FGFR. Ces données impliquent que seuls le FGFR1cI256A et le FGFR4I250A correspondant avaient une expression de surface cellulaire réduite. Comme dans le cas de la lignée cellulaire L6-FGFR1cWT, le cotraitement avec le FGF23 et l'αKlotho soluble des lignées cellulaires L6-FGFR3cWT et L6-FGFR4WT a stimulé de manière robuste la signalisation FGFR, détectée par la phosphorylation/activation des FGFR et les transducteurs de signal PLCγ1/FRS2α/ERK en aval. En revanche, les cellules exprimant FGFR1c, FGFR3c et FGFR4 mutés présentaient une phosphorylation de la tyrosine de la boucle A du FGFR diminuée et une activation réduite de PLCγ1, FRS2α et MAPK (Fig. 3b – d). Il est peu probable que la signalisation altérée par FGFR1cI256A et FGFR4I250A soit uniquement due à une expression de surface cellulaire réduite car la glycosylation et l'expression de surface cellulaire du FGFR3cI254A correspondant ne sont pas affectées.

Le FGF23 participe également au recrutement du FGFRS dans le complexe ternaire et donc au renforcement de la dimérisation du FGFRP-FGFRS. Ces contacts secondaires FGF23 – FGFRS sont médiés à la fois par le noyau en trèfle rigide et par l'extrémité N flexible de FGF23. Plus précisément, les boucles β8 – β9 et β10 – β12 dans le noyau en trèfle de FGF23 engagent les boucles βC – βD et βE – βF au bord inférieur (C-terminal) du domaine FGFRS D2 (Fig. 4a). En parallèle, des résidus hydrophobes à l'extrémité très distale de l'extrémité N du FGF23 s'étendent du complexe FGF23 – FGFRP – αKlotho et interagissent avec un sillon hydrophobe dans le domaine D3 du FGFRS qui correspond au sillon D3 du FGFRP engagé par le RBA de αKlotho ( Fig. 4a et données étendues Fig. 4a). Ce faisant, l'extrémité N du FGF23 est susceptible de décourager la liaison d'un autre αKlotho au FGFRS et contribue donc à l'asymétrie du complexe quaternaire. Par rapport à la structure cristalline du complexe 1: 1: 1 FGF23 – FGFR – αKlotho sans HS, l'extrémité N-terminale du FGF23 présente un changement conformationnel majeur dans le quaternaire 1: 2: 1: 1 FGF23 – FGFR – αKlotho – HS complexe (données étendues Fig. 4b – d). Notamment, dans les trois structures cryo-EM, les densités d'électrons pour l'extrémité FGF23 N sont mal définies, ce qui implique que l'extrémité FGF23 N engage FGFRS D3 de manière plutôt dégénérée et flexible (Fig. 1a – c et Données étendues Fig. 4e ). Les interactions de l'extrémité N du FGF23 avec le FGFRS D3 ont été corroborées par une simulation de dynamique moléculaire (DM) de tous les atomes de 300 ns du complexe FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS (Extended Data Fig. 4f – i). Semblable à l'interface FGFRP – FGFRS, l'interface FGF23 – FGFRS (tableau supplémentaire 2) est également conservée parmi les trois complexes quaternaires et masque une surface exposée plutôt modeste (1668, 6 Å2). Notamment, l'extrémité N du FGF23 et le D3 du FGFRS s'engagent à proximité du site 2 de l'interface FGFRP – FGFRS (Fig. 4a). Cela implique que les contacts FGF23 – FGFRS et FGFRP – FGFRS agissent de concert pour recruter FGFRS dans le complexe ternaire et favoriser la dimérisation des récepteurs (c'est-à-dire FGFRP – FGFRS).

a, Représentation en dessin animé de la structure FGF23 – FGFR – αKlotho – HS dans la même vue que sur la Fig. 1a (à droite). Les boîtes orange et noires signifient les deux régions de contact entre FGF23 et FGFRS, à savoir, FGF23core: domaine FGFR1cS D2 (à gauche, boîte orange) et FGF23NT: domaine FGFR1cS D3 (à droite). b, les cellules L6-FGFR1cWT ont été traitées avec des concentrations croissantes de FGF23WT, FGF23ΔNT ou FGF23ΔSRBS et les lysats de cellules entières ont été sondés comme sur la Fig. 2d). c, Perte des capacités des mutants FGF23ΔNT et FGF23ΔSRBS à induire la formation du complexe quaternaire FGF23 – FGFR – αKlotho – HS (c'est-à-dire la dimérisation des récepteurs) par rapport au FGF23WT, comme évalué par PLA. Notez qu'il y a beaucoup moins de taches rouges dans les cellules stimulées avec des mutants FGF23 par rapport à FGF23WT. d, les cellules L6-FGFR1cWT ont été traitées avec du FGF23WT (40 nM) seul, du FGF23WT (40 nM) mélangé avec du FGF23ΔSRBS (40 nM) ou du FGF23ΔNT (40 nM) et des extraits de cellules entières ont été sondés avec des anticorps pFGFR. Barre d'échelle, 10 μm. L'immunoblot (b et d, n = 3 expériences biologiquement indépendantes) et le PLA (c, n = 6 champs de microscope choisis au hasard à partir de deux expériences biologiquement indépendantes) ont été quantifiés comme décrit dans la section Méthodes et sont présentés sous forme de moyenne ± écart type. Les valeurs P ont été déterminées par ANOVA à deux voies suivie du test post hoc de comparaisons multiples de Tukey.

Données source

Ensuite, nous avons étudié l'impact de l'interférence avec les contacts secondaires FGF23 – FGFRS sur la formation du complexe de signalisation quaternaire 1: 2: 1: 1 FGF23 – FGFR – αKlotho – HS. À cette fin, nous avons généré deux variants de FGF23 : l'un dépourvu de ses 12 premiers résidus N-terminaux (c'est-à-dire Y25 à W36 ; appelé FGF23ΔNT), et l'autre portant une triple mutation M149A/N150A/P151A dans la région centrale du FGF23. (appelé FGF23ΔSRBS). Selon les structures cryo-EM, la triple mutation M149A / N150A / P151A et la troncature N-terminale devraient abroger les interactions secondaires du FGF23 avec les domaines D2 et D3 du FGFRS, respectivement, et donc altérer la signalisation du FGF23 (Fig. 4a). Pour tester cela, une lignée cellulaire L6 co-exprimant FGFR1cWT et αKlotho transmembranaire a été générée et exposée à des concentrations croissantes de FGF23WT, FGF23ΔNT ou FGF23ΔSRBS. Les efficacités de dimérisation / activation des récepteurs de concentrations croissantes de ligands ont été évaluées par immunotransfert pour la phosphorylation de la tyrosine en boucle A du FGFR et par PLA (Fig. 4b, c). La comparaison des courbes dose-réponse a montré qu'à toutes les concentrations, ni le FGF23ΔNT ni le FGF23ΔSRBS ne pouvaient atteindre l'activité maximale (Emax) exercée par le FGF23WT dans les deux tests. De plus, lorsqu'ils sont combinés avec le FGF23WT, le FGF23ΔSRBS et le FGF23ΔNT ont agi comme des antagonistes compétitifs, produisant une nette diminution de l'activation du FGFR1c (Fig. 4d). Cependant, par rapport au FGF23ΔNT, le FGF23ΔSRBS a montré une plus grande perte de sa capacité de dimérisation / signalisation (Fig. 4b – d), ce qui implique que les contacts FGF23 – FGFRS médiés via le noyau du FGF23 contribuent davantage à la stabilité globale et la fonctionnalité du Complexe de signalisation quaternaire FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS que ceux médiés par l'extrémité N de FGF23.

Nous avons conçu un test de complémentation des récepteurs à base de cellules pour interroger l'asymétrie des complexes de signalisation quaternaires FGF23-FGFR-αKlotho-HS. Plus précisément, sur la base des rôles distincts joués par les récepteurs primaires et secondaires dans la dimérisation asymétrique, nous avons conçu deux variants de FGFR1c capables d'agir exclusivement en tant que récepteur primaire ou secondaire. Nous avons estimé que bien que ces variantes seraient dysfonctionnelles individuellement, elles devraient se compléter et former un complexe quaternaire fonctionnel 1: 2: 1: 1 en réponse au FGF 23 et à αKlotho (Fig. 5a et Extended Data Fig. 5a, b). Pour générer un variant FGFR1c fonctionnant exclusivement comme récepteur primaire, nous avons introduit une double mutation I203E/S223E dans son domaine D2. Comme mentionné ci-dessus, ces deux résidus dans FGFR1cS s'engagent dans des contacts hydrophobes et de liaison hydrogène avec des résidus dans le noyau du FGF23 (c'est-à-dire l'interface FGF23 – FGFR1cS, Fig. 4a), qui sont indispensables pour le recrutement de FGFR1cS au complexe ternaire comme impliquée par la grave perte de fonction de FGF23ΔSRBS (Fig. 4b, c). Cependant, les résidus correspondants dans FGFR1cP sont indispensables pour la formation de complexes quaternaires et sont exposés au solvant (Extended Data Fig. 5b). Par conséquent, le mutant résultant FGFR1c (appelé FGFR1cΔSLBS) devrait perdre la capacité d'agir en tant que récepteur secondaire mais devrait conserver la capacité de servir de récepteur primaire. Pour fabriquer un variant FGFR1c capable d'agir uniquement comme récepteur secondaire, nous avons introduit une double mutation A167D/V248D dans son domaine D2. La double mutation A167D / V248D annule la formation d'hydrogène hautement conservé et de contacts hydrophobes entre FGF23 et le domaine FGFR1P D2 (Extended Data Fig. 5a, b). Ainsi, le mutant FGFR1cA167D/V248D résultant (appelé FGFR1cΔPLBS) devrait perdre la capacité de fonctionner en tant que récepteur primaire (c'est-à-dire former un complexe ternaire). Cependant, FGFR1cΔPLBS devrait conserver sa capacité à fonctionner en tant que récepteur secondaire car les résidus correspondants dans FGFR1cS ne jouent aucun rôle dans la formation du complexe quaternaire et sont complètement exposés au solvant.

a, Diagramme schématique montrant qu'en réponse au cotraitement FGF23 et αKlotho, FGFR1cΔSLBS et FGFR1cΔPLBS peuvent se compléter et former un complexe asymétrique 1: 1: 1: 1: 1 FGF23 – FGFR1cΔSLBS – FGFR1cΔPLB – αKlotho – HS. b, Analyses par immunoblot d'extraits entiers de lignées cellulaires L6 non traitées ou cotraitées avec FGF23 et αKlotho exprimant individuellement FGFR1cWT, FGFR1cΔPLBS et FGFR1cΔSLBS ou co-exprimant FGFR1cΔSLBS avec FGFR1cΔPLBS sondé comme dans la Fig. 2. c, Schéma montrant que FGF23, αKlotho et FGFR4ΔSLBS (servant de récepteur primaire) forme un complexe ternaire et recrute FGFR1cΔPLBS comme récepteur secondaire, en présence de HS. d, les lignées cellulaires L6 cotraitées avec FGF23 et αKlotho exprimant de manière stable FGFR4WT, FGFR4ΔSLBS seul ou FGFR4ΔSLBS avec FGFR1cΔPLBS ont été analysées pour l'activation/la signalisation du FGFR à l'aide d'un transfert Western de lysats cellulaires totaux comme sur la Fig. 2. e, Schéma de principe montrant que, dans réponse à la paracrine FGF1 / 4 et HS, FGFR1cΔSLBS et FGFR1cΔPLBS peuvent se compléter et former des complexes de signalisation asymétriques 1: 1: 1: 1 FGF – FGFR1cΔSLBS – FGFR1cΔPLBS – HS. f, les lignées cellulaires L6 exprimant FGFR1cΔSLBS et FGFR1cΔPLBS individuellement ou les co-exprimant ont été traitées avec FGF1 (1 nM) et des extraits cellulaires ont été immunoblottés comme sur la Fig. 2. g, Schéma de principe montrant que FGF1, HS et FGFR4ΔSLBS (servant de récepteur primaire ) forment un complexe stable qui recrute ensuite FGFR1cΔPLBS comme récepteur secondaire. h, les lignées cellulaires L6 exprimant FGFR4WT ou FGFR4ΔSLBS seuls ou co-exprimant FGFR4ΔSLBS avec FGFR1cΔPLBS ont été traitées avec FGF1 (1 nM) et des extraits cellulaires ont été immunotransférés comme sur la figure 2. Des expériences ont été réalisées en triple biologique avec des résultats similaires. CT, extrémité C ; NT, extrémité N.

Pour effectuer le test de complémentation, une lignée cellulaire L6 co-exprimant FGFR1cΔSLBS et FGFR1cΔPLBS (L6-FGFR1cΔSLBS + FGFR1cΔPLBS) a été générée avec deux lignées cellulaires L6 témoins exprimant individuellement FGFR1cΔSLBS (L6-FGFR1cΔSLBS) et FGFR1cΔPLBS (L6-FGFR1cΔPLBS). Ces trois lignées cellulaires et L6-FGFR1cWT (témoin positif) ont été exposées à une concentration fixe de FGF23 et d'αKlotho soluble pendant des intervalles de temps croissants. La signalisation FGFR1c a été évaluée en surveillant la phosphorylation de la tyrosine de FGFR, PLCγ1 et FRS2α, et l'activation ultérieure de la voie MAPK. Par rapport à la lignée cellulaire L6-FGFR1cWT, il y avait une signalisation FGFR négligeable dans les cellules L6-FGFR1cΔPLBS ou L6-FGFR1cΔSLBS (Fig. 5b), ce qui implique que ces variants seuls sont incapables de former des complexes quaternaires compétents en signalisation. En revanche, la co-expression de FGFR1cΔSLBS avec FGFR1cΔPLBS (Fig. 5b) a entraîné une activation robuste d'une voie de signalisation FGFR. Ces données impliquent que FGFR1cΔSLBS peut compléter FGFR1cΔPLBS en formant un complexe quaternaire FGF23 – FGFR1cΔSLBS – FGFR1cΔPLBS – αKlotho – HS, dans lequel FGFR1cΔSLBS assume le rôle de récepteur primaire tandis que FGFR1cΔPLBS est adopté comme récepteur secondaire (Fig. 5a). La formation d'un complexe de signalisation asymétrique FGF23 – FGFR1cΔSLBS – FGFR1cΔPLBS – αKlotho – HS a également été validée par PLA (Extended Data Fig. 5c). Par rapport aux cellules L6-FGFR1cWT, le cotraitement FGF23 et αKlotho n'a pas généré de signaux fluorescents à la surface des cellules L6-FGFR1cΔSLBS et L6-FGFR1cΔPLBS, ce qui implique que les variants FGFR1cΔSLBS et L6-FGFR1cΔPLBS seuls ne subissent pas de dimérisation du récepteur (c'est-à-dire formation complexe). En revanche, la stimulation des cellules co-exprimant L6-FGFR1cΔSLBS + FGFR1cΔPLBS avec FGF23 et αKlotho a conduit à l'apparition de puncta fluorescents abondants et intenses, ce qui implique que FGFR1cΔSLBS et FGFR1cΔPLBS se sont complétés et assemblés en un FGF23–FGFR1cΔSLBS–FGFR1cΔPLBS–α asymétrique. Klotho– Complexe de signalisation HS.

Comme mentionné ci-dessus, les interfaces FGFRP – FGFRS et FGF23 – FGFRS sont presque invariantes parmi les trois complexes quaternaires. Cette observation nous a offert une autre occasion d'interroger l'asymétrie du complexe. Plus précisément, nous avons estimé qu'un FGFR1cP primaire devrait pouvoir s'apparier avec FGFR3c ou FGFR4 en tant que récepteur secondaire pour donner un FGF23–FGFR1c–FGFR3c–αKlotho–HS ou FGF23–FGFR1c–FGFR4–αKloth–HS fonctionnel. complexes quaternaires hétérodimères (Fig. 5c). Pour tester cette possibilité, nous avons effectué un test de complémentation des récepteurs en utilisant un variant FGFR4 hébergeant une double mutation I197E/S217E (appelée FGFR4ΔSLBS) - correspondant à FGFR1cΔSLBS - comme récepteur primaire et FGFR1cΔPLBS comme récepteur secondaire. Une lignée cellulaire L6 co-exprimant FGFR1cΔPLBS avec FGFR4ΔSLBS (L6-FGFR1cΔPLBS + FGFR4ΔSLBS), ainsi que des lignées cellulaires témoins exprimant individuellement FGFR4WT (L6-FGFR4WT) et FGFR4ΔSLBS (L6-FGFR4ΔSLBS) ont été dérivées. Ces lignées cellulaires ont été cotraitées avec FGF23 plus αKlotho, et la formation d'un complexe de signalisation quaternaire a été examinée par analyse immunoblot et PLA. Comme avec FGFR1cΔSLBS et FGFR1cΔPLBS, FGFR4ΔSLBS n'a pas non plus été activé en réponse au co-traitement FGF23 plus αKlotho. Cependant, une activation robuste d'une voie de signalisation FGFR a eu lieu dans la lignée cellulaire co-exprimant L6-FGFR1cΔPLBS + FGFR4ΔSLBS (Fig. 5d). Les données de signalisation cellulaire ont été reflétées par le PLA (Extended Data Fig. 5c). Plus précisément, un signal fluorescent sans conséquence était présent à la surface de la lignée cellulaire L6-FGFR4ΔSLBS lors de la co-stimulation avec FGF23 et αKlotho. En revanche, des taches fluorescentes ponctuées abondantes et intenses sont apparues à la surface des cellules co-exprimant L6-FGFR1cΔPLBS + FGFR4ΔSLBS, ce qui implique qu'un complexe quaternaire hétérodimérique FGF23 – FGFR1c – FGFR4 – αKlotho – HS peut se former à la surface des cellules vivantes. Ces données de complémentation et d'hérodimérisation des récepteurs cellulaires confirment sans équivoque l'asymétrie de notre complexe de transduction de signal 1: 2: 1: 1 FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS, structurellement déduit.

Étant donné que le corécepteur αKlotho ne participe pas directement au recrutement du FGFRS, nous avons suggéré que le mode asymétrique de dimérisation des récepteurs révélé par nos structures cryo-EM FGF23 – FGFR – αKlotho – HS pourrait également être pertinent pour les FGF paracrines. Pour tester cette conjecture, nous avons étudié les impacts des mutations asymétriques de l'interface dimère FGFRP – FGFRS sur les capacités de FGFR1c et FGFR2b à médier la signalisation FGF paracrine. Ces deux isoformes de FGFR ont été choisies en raison de leur chevauchement et de leur profil unique de spécificité / promiscuité de liaison au ligand (Extended Data Fig. 5d). FGFR1c répond au FGF1 paracrine (un ligand pan-FGFR) et FGF4, tandis que FGFR2b médie les actions de FGF1, FGF3, FGF7, FGF10 et FGF22. Pour les études FGFR2b, nous avons généré des lignées cellulaires L6 exprimant des mutants de type sauvage (FGFR2bWT) ou FGFR2b (c'est-à-dire FGFR2bE250A, FGFR2bR255A, FGFR2bI257A et FGFR2bY281A) analogues aux mutants FGFR1c mentionnés ci-dessus. Les mutants FGFR1c et FGFR2b étaient tous deux altérés dans leur capacité à subir une auto-phosphorylation de la tyrosine trans induite par le ligand, ce qui était également réciproque dans la phosphorylation réduite de PLCγ1 et FRS2α (Extended Data Fig. 6).

Ensuite, nous avons effectué des tests de complémentation et d'hétérodimérisation des récepteurs comme cela a été fait pour le FGF23. Pour l'étude de complémentation de FGFR2b, nous avons établi des lignées cellulaires L6-FGFR2bΔSLBS, L6-FGFR2bΔPLBS et L6-FGFR2bΔSLBS + FGFR2bΔPLBS correspondant aux lignées cellulaires FGFR1c utilisées pour l'étude FGF23. En réponse à la stimulation par FGF1 ou FGF4, les cellules exprimant FGFR1cΔPLBS ou FGFR1cΔSLBS seuls n'ont pas réussi à susciter une signalisation FGFR1c appréciable, tandis que les cellules L6-FGFR1cΔSLBS + FGFR1cΔPLBS ont répondu par une activation et une signalisation robustes de FGFR1c (Fig. 5e, f). De même, FGF1, FGF3, FGF7 et FGF10 ont chacun induit l'activation et la signalisation du FGFR uniquement dans les co-expresseurs L6-FGFR2bΔSLBS + FGFR2bΔPLBS (Extended Data Fig. 7). Enfin, nous avons étudié la possibilité d'hétérodimérisation du FGFR par les FGF paracrines en nous concentrant sur : (1) les hétérodimérisations du FGFR1c–FGFR4 et du FGFR1b–FGFR2b par le FGF1 ; (2) hétérodimérisation FGFR1b – FGFR2b par FGF10; et (3) hétérodimérisation FGFR2b – FGFR3b par FGF3. Pour le test d'hétérodimérisation FGFR1b – FGFR2b, nous avons généré une lignée cellulaire L6 exprimant FGFR1bΔSLBS, équivalente à FGFR2bΔSLBS. Pour l'hétérodimérisation FGF2b – FGFR3b par FGF3, nous avons utilisé le FGFR3b de type sauvage (FGFR3bWT) comme équivalent ΔPLBS car cette isoforme ne répond naturellement pas au FGF3. FGF1 n'a pas réussi à activer la signalisation FGFR dans les lignées cellulaires FGFR1cΔPLBS et FGFR4ΔSLBS. Cependant, une forte signalisation FGFR a été observée dans la lignée cellulaire co-exprimant FGFR1cΔPLBS + FGFR4ΔSLBS en réponse à la stimulation par FGF1 (Fig. 5g, h). De même, FGF1 et FGF10 ont induit une activation / signalisation FGFR robuste uniquement dans la lignée cellulaire co-exprimant FGFR1bΔSLBS + FGFR2bΔPLBS, mais pas dans les lignées cellulaires L6-FGFR1bΔSLBS et L6-FGFR2bΔPLBS (Extended Data Fig. 8a – c). Enfin, le FGF3 a provoqué une signalisation dans la lignée cellulaire co-exprimant FGFR2bΔSLBS + FGFR3bWT, mais pas dans les cellules L6-FGFR2bΔSLBS et L6-FGFR3bWT (données étendues Fig. 8d, e). Sur la base de ces données cellulaires étendues, nous concluons que la signalisation FGF paracrine est médiée par des dimères asymétriques 1: 2 FGF – FGFR induits par HS, rappelant le dimère endocrinien 1: 2 FGF23 – FGFR induit par HS et Klotho (Extended Data Fig. . 9).

Les structures complexes quaternaires asymétriques 1: 2: 1: 1 FGF23 – FGFR – αKlotho – HS et les données biochimiques à l'appui présentées dans ce manuscrit révèlent comment les corécepteurs de glycosaminoglycanes Klotho et HS agissent de concert pour favoriser la dimérisation endocrinienne FGF – FGFR asymétrique 1: 2 nécessaire pour l'activation des récepteurs et donc la signalisation de l'hormone FGF. Dans ce modèle, les corécepteurs de Klotho attachent ensemble l'hormone FGF et son récepteur primaire et génèrent ainsi un complexe endocrinien stable FGF – FGFRP dans le contexte de complexes ternaires 1: 1: 1 FGF – FGFRP – Klotho. Ce faisant, les corécepteurs de Klotho compensent efficacement l'incompétence du HS à stabiliser le complexe endocrinien FGF – FGFRP (Extended Data Fig. 9). Le complexe endocrinien stabilisé FGF-FGFRP est ensuite assisté par un corécepteur HS pour recruter un FGFRS secondaire. Il est important de noter que la dépendance au corécepteur Klotho limite le site d'action des hormones FGF aux tissus/organes exprimant Klotho (c'est-à-dire les reins et les glandes parathyroïdes dans le cas du FGF23). Conformément à l'absence d'un rôle direct de Klotho dans le recrutement de FGFRS, nous montrons que le mode asymétrique de dimérisation des récepteurs est également applicable aux FGF paracrines. Contrairement aux hormones FGF, les FGF paracrines ont une affinité substantielle pour HS et peuvent donc compter uniquement sur HS en tant que corécepteur obligatoire pour à la fois lier de manière stable FGFRP et recruter FGFRS. Malgré le partage de similitude structurelle, les dimères endocriniens 1: 2 FGF – FGFR induits par Klotho et HS sont thermodynamiquement inférieurs aux dimères paracrine 1: 2 FGF – FGFR induits par HS. Plus précisément, en raison de la faible affinité de liaison HS de l'hormone FGF, le FGFRS est lié moins étroitement dans le dimère endocrinien 1: 2 FGF – FGFR, ce qui explique la plus faible capacité d'activation / signalisation des récepteurs des hormones FGF par rapport aux FGF paracrine comme postulé par notre « modèle de seuil » pour la spécificité de signalisation du FGF38. Remarquablement, le modèle de dimérisation asymétrique des récepteurs est compatible avec l'hétérodimérisation des récepteurs, qui est susceptible de servir de mécanisme supplémentaire pour affiner qualitativement et quantitativement la signalisation FGF.

Le kit de clonage In-Fusion HD indépendant de la ligation (n° 639648, Clontech) a été utilisé pour construire des vecteurs lentiviraux pEF1α-IRES-neo et pEF1α-IRES-hygro résistants à la néomycine et à l'hygromycine codant pour les FGFR2c, FGFR3c et FGFR3c humains pleine longueur de type sauvage. FGFR4 selon le protocole précédemment décrit pour la construction d'expression lentivirale humaine FGFR1c6. La construction d'expression bactérienne à base de pET-30a pour le FGF23 humain à étiquette N-terminale (résidus Tyr25 à Ile251) a été décrite précédemment6. Les vecteurs d'expression pHLsec codant pour la région extracellulaire de liaison au ligand (c'est-à-dire la région D2-D3) de FGFR3c (résidus Asp142 à Arg365 ; FGFR3cecto) et FGFR4 (résidus Asp142 à Arg365 ; FGFR4ecto) ont été fabriqués selon la même stratégie décrite précédemment pour l'humain. FGFR1cecto (réf. 6). Des mutations et des troncatures de sites uniques et multiples ont été introduites dans des constructions d'expression codant pour les protéines de type sauvage à l'aide d'un kit de mutagenèse dirigée sur site Q5 (n° E0554S, New England Biolabs Inc.). Les constructions d'expression ont été vérifiées par digestion par des enzymes de restriction et séquençage d'ADN.

Pour produire des ectodomaines minimalement glycosylés de FGFR1c, 3c et 4, des cellules HEK293S déficientes en N-acétylglucosaminyltransférase I (GnTI-) ont été transfectées de manière transitoire avec des constructions d'expression pHLsec respectives via un polymère cationique polyéthylèneimine (PEI, n ° 23966-1, Polysciences, Inc.) suivant un protocole publié40. Ensuite, 24 h après la transfection, de la tryptone N1 (TN1, catalogue n° 19553, Organotechnie) a été ajoutée au milieu pour favoriser l'expression de la protéine. Au troisième jour, les ectodomaines FGFR sécrétés à partir de 1 l de milieu conditionné ont été capturés sur une colonne HiTrap d'affinité à l'héparine (n° 17040703, GE Healthcare) et élués avec 20 volumes de colonne de gradient de sel (0–2 M). Les fractions contenant les protéines FGFRecto ont été regroupées, concentrées à 5 ml et appliquées sur une colonne de filtration sur gel Superdex-75 (n° 28989333, GE Healthcare). Les protéines FGFRecto ont été éluées de manière isocratique dans un tampon HEPES 25 mM pH = 7,5 contenant 1 M de NaCl. Les protéines FGF23 de type sauvage et mutées ont été exprimées dans E. coli sous forme de corps d'inclusion, repliées in vitro et purifiées jusqu'à homogénéité par échange séquentiel de cations et SEC selon un protocole établi6. L'αKlothoecto sécrété a été purifié à partir de milieux conditionnés d'une lignée cellulaire HEK293S GnTI− exprimant de manière stable l'ensemble du domaine extracellulaire de l'αKlotho humain (résidus Met1 à Ser981; αKlothoecto) à l'aide d'une colonne HiTrap d'affinité à l'héparine suivie d'une chromatographie sur colonne SOUCRE Q anion et Superdex 200, comme décrit auparavant6.

Des complexes quaternaires FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS, FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS ou FGF23–FGFR4–αKlotho–HS ont été préparés en mélangeant FGF23 avec l'un des ectodomaines de FGFR, αKlothoecto et un dodécasaccharide d'héparine 12 (HO12, Iduron Ltd) en utilisant un rapport molaire de 1:1:1:1. Les mélanges ont été concentrés à environ 5 mg ml-1, appliqués sur une colonne Superdex 200 (n° 28989335, GE Healthcare) et élués de manière isocratique dans un tampon HEPES 25 mM pH = 7,5 contenant 100 mM NaCl. Les fractions maximales ont été analysées par SDS-PAGE et les fractions supérieures contenant la concentration et la pureté les plus élevées du complexe quaternaire ont été utilisées directement pour la préparation de la grille sans concentration supplémentaire pour éviter l'agrégation des protéines. Les concentrations finales des complexes FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS, FGF23 – FGFR3c – αKlotho – HS et FGF23 – FGFR4 – αKlotho – HS pour la préparation de la grille étaient de 1, 5, 2, 4 et 1, 5 mg ml-1, respectivement.

Pour préparer les grilles cryo-EM, 2 à 3 μl de complexe protéique purifié à environ 1, 5 à 2, 5 mg ml -1 ont été appliqués sur une grille en or déchargée par lueur (UltrAuFoil). La grille a ensuite été épongée pendant 1 à 2 s sous 0 ou 1 force à 100 % d'humidité à l'aide d'un Mark IV Vitrobot (FEI) avant de plonger dans de l'éthane liquide. Des micrographies des complexes FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS et FGF23 – FGFR4 – αKlotho – HS ont été acquises sur un microscope Talos Arctica avec détecteur d'électrons direct K2 à un grossissement × 36 000 (correspondant à 1, 096 Å par pixel). Les doses cumulées utilisées étaient de 50,37 e−/Å2 et 53,84 e−/Å2 pour FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS et FGF23–FGFR4–αKlotho–HS, respectivement. Des micrographies du complexe FGF23 – FGFR3c – αKlotho – HS ont été collectées sur un microscope Titan Krios équipé d'un détecteur d'électrons direct K2 et d'un filtre d'énergie. Le grossissement utilisé était de ×130 000, avec une taille de pixel de 1,048 Å et une dose cumulée de 72,44 e–/Å2. Leginon41 a été utilisé pour cibler les trous avec une épaisseur de glace de 5 à 100 nm, ce qui a permis de collecter 10 186, 6 409 et 16 602 micrographies pour chacun des trois complexes quaternaires.

WARP42 a été utilisé pour la correction de mouvement et l'estimation de la fonction de transfert de contraste pour les trois ensembles de données cryo-EM. Les micrographies avec une résolution globale inférieure à 5,5 Å ont été exclues. Le nombre final de micrographies utilisées était de 9 501, 5 164 et 15 049, respectivement, produisant plus d'un million de particules pour chaque complexe. Les empilements de particules ont ensuite été importés dans cryoSPARC43 pour une classification bidimensionnelle, une reconstruction ab-initio avec trois ou quatre modèles et une classification tridimensionnelle. Enfin, 1 497 967 (FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS), 291 540 (FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS) et 856 877 (FGF23–FGFR4–αKlotho–HS) particules ont été utilisées pour un raffinement hétérogène avec une symétrie C1, résultant en 2,74, 3,20 et résolutions de 3,03 Å, respectivement. Les composants / domaines des structures à rayons X FGF23 – FGFR1c – αKlotho (PDB : 5W21) ont été ancrés manuellement dans des cartes de densité cryo-EM à l'aide de Chimera44 et le corps rigide a été affiné. Les modèles initiaux ont ensuite été ajustés dans Coot45 et affinés en espace réel dans Phenix46. Les statistiques de raffinement et de modèle sont présentées dans le tableau de données étendu 1. Des images cryo-EM représentatives, des moyennes de classe bidimensionnelles et des cartes tridimensionnelles de chaque complexe quaternaire sont présentées dans les données étendues de la figure 1.

La structure cryo-EM du complexe quaternaire FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS a été solvatée dans une boîte à eau de 16 × 16 × 16 nm3. Le serveur CHARMM-GUI a été utilisé pour générer la configuration, la topologie47,48,49,50 et les fichiers de paramètres avec le champ de force CHARMM36m51. En plus des molécules de protéines, le système de simulation comprenait environ 138 073 molécules d'eau, 393 ions sodium et 393 ions chlorure (imitant le NaCl 150 mM présent dans le tampon protéique), ce qui donne un total de 439 298 atomes. Une trajectoire de simulation MD tous atomes de 300 ns a été générée à l'aide de GROMACS 2021 (réf. 52) à 303 K en utilisant un pas de temps de 2 fs. La condition aux limites périodique cubique a été utilisée lors des simulations et l'interaction de van der Waals a été désactivée de 1 nm à 1,2 nm. Les interactions électrostatiques à longue portée ont été calculées à l'aide de la méthode du maillage de particules d'Ewald (PME). La minimisation de l'énergie a été effectuée à l'aide de l'algorithme de descente la plus raide, suivi d'une simulation d'équilibrage du nombre, du volume et de la température (NVT) de particules constantes de 0,4 ns et d'une simulation d'équilibrage du nombre, de la pression et de la température (NPT) de particules constantes de 20 ns en diminuant progressivement les contraintes de force à partir de 1000 kJ mol-1 nm-2 à 400 kJ mol-1 nm-2 (pour l'étage NVT) et 400 kJ mol-1 nm-2 à 40 kJ mol-1 nm-2 (pour l'étage NPT). À la fin des étapes d'équilibrage, toutes les contraintes de force ont été supprimées et la simulation MD a été effectuée dans l'ensemble NPT.

Des cellules HEK293T (vérifiées par un contrôle morphologique au microscope, mycoplasme négatif en 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)) ont été utilisées pour le conditionnement de vecteurs lentiviraux et la production de particules virales à haut titre. Une lignée cellulaire de myoblastes L6 (n° GNR 4, National Collection of Authenticated Cell Cultures) a été utilisée comme hôte pour l'expression stable de FGFR1c humain complet (transmembranaire), FGFR2c, FGFR3c, FGFR4 et leurs mutants. Les cellules L6 expriment de manière endogène les HSPG mais sont dépourvues de FGFR et de corécepteur αKlotho et sont donc naturellement insensibles au FGF23. Cependant, via une co-expression ectopique contrôlée de FGFR apparentés et d'αKlotho ou une supplémentation exogène avec de l'αKlothoecto soluble, ces cellules peuvent répondre à la stimulation du FGF23. En conséquence, les cellules L6 sont d'excellents hôtes pour les études de reconstitution de la signalisation FGF23 dans un environnement physiologique. Les cellules HEK293T et L6 ont été maintenues dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, n° C11995500BT, Gibco) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, n° FSD500, ExCell Bio), 100 U ml-1 de pénicilline et 100 μg ml -1 Streptomycine (n° P1400, Solarbio). L'encapsidation virale et la génération des particules de lentivirus recombinants dans les cellules HEK293T ont été réalisées à l'aide de protocoles publiés33. Pour une expression stable de lignées cellulaires FGFR individuelles de type sauvage ou mutées, 2 × 105 cellules L6 ont été étalées dans des boîtes de culture cellulaire à six puits et infectées avec des particules de lentivirus codant pour le FGFR donné en présence de polybrène (5 μg ml-1; no. sc-134220, biotechnologie de Santa Cruz). Des transfectants stables ont été sélectionnés à l'aide de G418 (0,5 mg ml-1, n° HY-17561, MedChemExpress) ou d'hygromycine (8 µg ml-1, n° HY-B0490, MedChemExpress). Pour la lignée cellulaire co-exprimant FGFR1c+αKlothoTM, des cellules L6 exprimant de manière stable FGFR1cWT (résistantes au G418) ont été infectées par des particules lentivirales codant pour l'αKlotho transmembranaire sauvage ou muté (αKlothoTM) et les cellules co-exprimant ont été sélectionnées à l'aide d'hygromycine (80 μg ml-1, n° HY-B0490, MedChemExpress).

Pour les études de stimulation cellulaire, des cellules L6 parentales et transfectées de manière stable ont été ensemencées dans des plaques de culture cellulaire à 12 puits à une densité de 1 × 105 cellules par puits et maintenues pendant 24 h. Le lendemain, les cellules ont été rincées trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis privées de sérum pendant 12 h et co-stimulées avec FGF23WT et αKlothoecto pendant 5, 10, 20 et 40 min. Pour la stimulation ponctuelle, les échantillons ont été récoltés après 5 min.

Après stimulation, les cellules ont été lysées et les échantillons de lysats totaux ont été analysés par western blot, comme décrit précédemment33. Les anticorps suivants ont été utilisés : FGFR phosphorylé (1:1000, n° 3471S, Cell Signaling Technology), FRS2α phosphorylé (1:1000, n° 3864S, Cell Signaling Technology), PLCγ1 phosphorylé (1:1000, n° 2821S, Cell Signaling Technology), ERK1/2 phosphorylé (1:1000, n° 4370S, Cell Signaling Technology), α-tubuline (1:20000, n° 66031-1-Ig, Proteintech), total-FGFR1 (1:1000, non 9740S, Cell Signaling Technology), total-FGFR2 (1:1000, no. 23328S, Cell Signaling Technology), total-FGFR3 (1:1000, no. ab133644, Abcam), total-FGFR4 (1:1000, no. 8562S, Cell Signaling Technology), HRP conjugué chèvre anti-souris IgG (H + L) (1:5000, n° SA00001-1, Proteintech), HRP conjugué chèvre anti-lapin IgG(H + L) (1:5000, n° SA00001-2, Proteintech). Les transferts ont été développés en utilisant des réactifs de chimioluminescence améliorés (n° P10300, NCM Biotech Laboratories) par le système ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad) ou Amersham ImageQuant 800 (GE).

La sensibilité à l'endoglycosidase H (Endo H) a été utilisée pour analyser les impacts potentiels des mutations de l'ectodomaine sur la glycosylation/maturation du FGFR et donc sur le trafic vers la surface cellulaire. Dans les immunoblots, les FGFR de type sauvage migrent sous la forme d'un doublet d'une bande supérieure diffuse majeure et d'une bande inférieure aiguë mineure. La bande supérieure représente le FGFR mature entièrement glycosylé, décoré de sucres complexes qui a passé le contrôle de qualité ER et a été acheminé avec succès vers la surface cellulaire. D'autre part, la bande inférieure à migration plus rapide est une forme à haute teneur en mannose incomplètement traitée qui est piégée dans le RE. Les mutations affectant la maturation des récepteurs se manifestent par une augmentation de la proportion de la bande résidente du RE qui migre plus rapidement. La forme riche en mannose est sensible à Endo H qui clive la liaison entre deux sous-unités N-acétylglucosamine (GlcNAc) directement proximales au résidu asparagine. Cependant, la bande de surface cellulaire entièrement glycosylée est résistante à Endo H. En conséquence, l'abondance de FGFR à la surface cellulaire peut être exprimée sous la forme d'un rapport de la fraction résistante à Endo H sur l'expression totale du récepteur, déterminée en traitant le récepteur avec PNGase F Cette enzyme est une amidase qui hydrolyse la liaison entre la GlcNAc la plus interne et l'asparagine, quelle que soit la teneur en sucre complexe, et ainsi débarrasse complètement le FGFR de tous ses sucres N-liés. En conséquence, les lignées cellulaires WT ou mutantes FGFR ont été lysées dans un tampon de lyse NP-40 (Biotime, n° P0013F, additionné de PMSF 1 mM) pendant 15 min à 4 ° C. Tout d'abord, 20 μg de protéines totales (quantifiées par dosage BCA) ont été dénaturées avec un tampon de dénaturation de la glycoprotéine à 100 ° C pendant 10 min, puis traitées avec 500 unités d'Endo H (New England Biolabs, n ° P0702S) ou peptide-N-glycosidase F (PNGase F) (New England Biolabs, n° P0704S) en suivant les instructions du fabricant. Les échantillons traités à l'endo H et à la PNGase F ont été immunotransférés avec des anticorps spécifiques à l'isoforme du FGFR, comme détaillé ci-dessus.

La masse moléculaire du complexe quaternaire FGF23 – FGFR1c-αKlotho – HS purifié par SEC a été déterminée par diffusion de la lumière multi-angle selon le protocole établi6. Avant l'expérience, au moins 60 ml de tampon de fonctionnement dégazé (25 mM HEPES pH 7,5 contenant 150 mM de NaCl) ont été passés à travers le système pour équilibrer la colonne et établir des lignes de base stables pour la diffusion de la lumière et les détecteurs d'indice de réfraction. Ensuite, 50 μl de complexe quaternaire FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS purifié (1,5 mg ml-1) ont été injectés sur la colonne Superdex 200 10/300 GL et l'éluant a été contrôlé en continu à 280 nm d'absorbance, de diffusion de la lumière laser et d'indice de réfraction. à un débit de 0,5 ml min-1. À titre de contrôle, 50 μl d'un échantillon de complexe ternaire FGF23 – FGFR-αKlotho purifié (1, 5 mg ml-1) ont été analysés dans les mêmes conditions. Les expériences ont été réalisées à température ambiante. L'intensité de diffusion de la lumière laser et les valeurs d'indice de réfraction de l'éluant ont été utilisées pour dériver la masse moléculaire telle qu'implémentée par le logiciel ASTRA (Wyatt Technology Corp.).

Les cellules ont été ensemencées sur des couvre-verres de microscope (n ° WHB-12-CS-LC, WHB) placés dans des boîtes de culture cellulaire à 12 puits à 1 × 105 cellules par puits et laissées adhérer pendant 24 h. Le lendemain, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et le sérum a été privé de sérum pendant 12 h. Après co-stimulation avec FGF23WT et αKlothoecto pendant 20 min, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et fixées avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 30 min avant PLA. La réaction PLA a été réalisée à l'aide d'un kit Duolink PLA en suivant les instructions du fabricant (n° DUO92101, Sigma-Aldrich) et visualisée par microscopie à fluorescence. En bref, les lames ont été traitées avec une solution de blocage pendant 60 min à 37 ° C, rincées trois fois avec du tampon de lavage A, puis incubées pendant une nuit à 4 ° C avec deux anticorps primaires différents élevés dans deux espèces différentes pour chaque isoforme FGFR d'intérêt (FGFR1 ( 1:20, n° PA5-25979, ThermoFisher) de lapin, FGFR1 (1:100, n° ab824, Abcam) de souris, FGFR2 (1:100, n° 23328S, Cell Signaling Technology) de lapin, FGFR2 (1 :50, n° sc-6930, Santa Cruz Biotechnology) de souris, FGFR3 (1:100, n° MA5-32620, ThermoFisher) de lapin, FGFR3 (1:100, n° sc-13121, Santa Cruz Biotechnology) de souris, FGFR4 (1:100, n° 8562S, Cell Signaling Technology) de lapin, FGFR4 (1:100, n° sc-136988, Santa Cruz Biotechnology) de souris). Après trois rinçages avec le tampon de lavage A, les lames ont été incubées avec des anticorps secondaires oligo-liés (Duolink anti-souris moins et anti-lapin plus) pendant 1 h à 37 °C. Les lames ont été rincées à nouveau avec le tampon de lavage A et immergées dans une solution de ligase pendant 30 min à 37 ° C, pour permettre la formation d'ADN circulaire, suivies d'une incubation avec une solution de polymérase pendant 100 min à 37 ° C pour une amplification en cercle roulant dans une chambre noire. Les lames ont été rincées deux fois avec le tampon de lavage B pendant 10 min chacune, puis rincées avec une dilution de 100 fois du tampon B pendant 1 min. Pour l'analyse d'imagerie, les lames ont été recouvertes de lamelles en utilisant un volume minimal de milieu de montage Duolink PLA contenant du DAPI. Les lames ont été examinées à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (C2si, Nikon).

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism 8.0. Pour l'analyse statistique des données d'immunotransfert, des valeurs densitométriques (déterminées à l'aide d'ImageJ) de trois expériences indépendantes ont été utilisées. Pour l'analyse statistique des données PLA, un certain nombre de points fluorescents et de cellules (comptés manuellement) ont été utilisés à partir de six champs de microscope choisis au hasard à partir de deux expériences biologiquement indépendantes. Le traitement des données Western blot et PLA sur les Fig. 2c,d, 3b–d et 4b,c ont été réalisés en utilisant une ANOVA à deux facteurs, suivie de Tukey. Une ANOVA à une voie, suivie de Tukey, a été appliquée pour traiter les données de Western blot dans Extended Data Fig. 3. Les purifications de protéines ont été répétées au moins huit fois, produisant des échantillons de pureté/quantité comparables. Des expériences de Western blot ont été réalisées en triple exemplaire biologique avec des résultats similaires. Les dosages PLA ont été répétés au moins deux fois indépendamment, avec des résultats analogues.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Cartes de densité électronique et modèles affinés pour le FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS (EMD-34075, PDB : 7YSH), FGF23–FGFR3c–αKlotho–HS (EMD-34082, PDB : 7YSU) et FGF23–FGFR4–αKlotho–HS ( EMD-34084, PDB : 7YSW) des complexes quaternaires ont été déposés dans la banque de données de microscopie électronique et seront publiés dès l'acceptation du manuscrit. Les images brutes de Western blot non recadrées sont compilées dans la Fig. 1 supplémentaire. Les données sources sont fournies avec cet article.

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Le soutien financier a été fourni par le programme national clé de R&D de Chine (2017YFA0506000 à XL), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82073705 et 82273842 à GC, 82103999 à LC, 81930108 à GL), le fonds de démarrage du laboratoire Oujiang (OJQD2022007 à MM), Prix ​​​​du plan d'action de Kungpeng (à MM), financement des sciences naturelles de la province du Zhejiang (LR22H300002 à GC, LQ22H300007 à LC), projet majeur d'innovation scientifique et technologique de Wenzhou (ZY2021023 à GC), Qianjiang Talent Plan of Zhejiang (QJD1902016 à GC) et Wenzhou Fonds de démarrage de l'Institut (UCAS) (WIUCASQD2021043, à YW).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Lingfeng Chen, Lili Fu, Jingchuan Sun, Zhiqiang Huang, Mingzhen Fang

Laboratoire Oujiang (Laboratoire Zhejiang pour la médecine régénérative, la vision et la santé cérébrale), École des sciences pharmaceutiques, Université médicale de Wenzhou, Wenzhou, Chine

Lingfeng Chen, Lili Fu, Jingchuan Sun, Zhiqiang Huang, Mingzhen Fang, Xin Liu, Junliang Lu, Zixiang Pan, Yang Wang, Xiaokun Li, Gaozhi Chen et Moosa Mohammadi

École des sciences pharmaceutiques, Hangzhou Medical College, Hangzhou, Chine

Lingfeng Chen et Guang Liang

Institut du facteur de croissance cellulaire, Laboratoire Oujiang (Laboratoire du Zhejiang pour la médecine régénérative, la vision et la santé cérébrale), Wenzhou, Chine

Lili Fu, Zhiqiang Huang, Mingzhen Fang, Xin Liu, Junliang Lu, Zixiang Pan, Gaozhi Chen et Moosa Mohammadi

Laboratoire clé d'État pour les médicaments macromoléculaires et la préparation à grande échelle, Université médicale de Wenzhou, Wenzhou, Chine

Lili Fu et Xiaokun Li

Laboratoire de contrôle du destin cellulaire, École des sciences de la vie, Université Westlake, Hangzhou, Chine

Soleil Jingchuan

Département de physiologie et de biophysique cellulaire, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, États-Unis

Allen Zinklé

Centre de physique biomédicale, Institut de Wenzhou, Université de l'Académie chinoise des sciences, Wenzhou, Chine

Yang Wang

Centre national de recherche en ingénierie sur les médicaments à facteur de croissance cellulaire et les protéines biologiques, Université médicale de Wenzhou, Wenzhou, Chine

Xiaokun Li

Institut des maladies rénales chroniques, Université médicale de Wenzhou, Wenzhou, Chine

Gaozhi Chen

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LC a exprimé, purifié et préparé les complexes quaternaires, effectué la chromatographie d'exclusion de taille - analyse de diffusion de la lumière multi-angle et préparé les figures structurelles. LC et JS ont préparé les grilles cryo-EM, puis collecté et traité les images. AZ a exprimé et purifié les ectodomaines de FGFR. LF a généré les constructions d'expression de mammifère. JL a exprimé les protéines mutantes FGF23. LF, ZH, MF, XL, ZP et GC ont généré des données de transfert Western et PLA et ont préparé les figures associées. YW a généré des données de simulation MD. MM a conçu le projet, construit et analysé les modèles structurels et rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont participé à la discussion et à la révision du manuscrit.

Correspondance à Xiaokun Li, Gaozhi Chen ou Moosa Mohammadi.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie Makoto Kuro-o et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Flux de travail de traitement d'image pour le complexe quaternaire FGF23-FGFR-αKlotho-HS contenant FGFR1c (à gauche), FGFR3c (au milieu) ou FGFR4 (à droite) comme composant récepteur. La corrélation de coquille de Fourier étalon-or (GSFSC) montre des résolutions globales de 2,74, 3,20 et 3,03 Å pour les complexes quaternaires FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS, FGF23-FGFR3c-αKlotho-HS et FGF23-FGFR4-αKlotho-HS, respectivement.

A, Représentation en dessin animé de la structure cryo-EM du complexe quaternaire 1: 2: 1: 1 FGF23-FGFR-αKlotho-HS dans quatre orientations différentes liées par une rotation de 90 ° le long de l'axe vertical. Le complexe quaternaire asymétrique a une dimension moyenne de 130 Å × 100 Å × 55 Å. La proximité des points d'insertion membranaire des chaînes FGFR (~ 25 Å de distance) serait propice à la formation d'un dimère trans-phosphorylant à boucle A asymétrique du domaine kinase intracellulaire27. FGF23, αKlotho et HS sont représentés respectivement en orange, bleu et magenta. Le récepteur primaire (FGFRP) et le récepteur secondaire (FGFRS) sont représentés en vert pâle et cyan. Les lignes pointillées indiquent les résidus 172 à 182 de FGF23, le lieur entre le noyau en trèfle de FGF23 et son site de liaison αKlotho distal, qui n'a pas pu être construit en raison du manque de densité électronique interprétable. Cette région n'interagit ni avec αKlotho ni avec le FGFR et est probablement désordonnée/flexible. Notamment, cette région abrite le site régulateur de la proprotéine convertase (SPC) de type subtilisine, 176RHT178R179/S180AE182, qui comprend un site de clivage de la protéase de type furine (R179), un site de O-glycosylation (T178) et un site de phosphorylation de la sérine (S180). Trois enzymes, à savoir GalNAc-T3 (N-acétylgalactosaminyltransférase3), Fam20C (la famille avec une similarité de séquence 20, membre C) et une protéase de type furine encore à découvrir convergent sur ce site pour réguler le traitement du FGF23. La grande flexibilité de cette région est probablement nécessaire à l'action de ces enzymes. B, la signalisation FGF23 est strictement dépendante de αKlotho. Les cellules L6-FGFR1cWT ont été traitées avec des concentrations croissantes de FGF23WT recombinant seul, en combinaison avec αKlotho soluble ou non traitées. Lysats de cellules entières immunoblottés comme sur la figure 2c. Notez que même les concentrations supra pharmacologiques (jusqu'à 10 micromolaires) de FGF23WT ne parviennent pas à activer la signalisation FGFR1c. Cependant, lorsqu'il est co-traité avec αKlotho soluble, aussi peu que 10 nM de FGF23 induit une activation robuste de FGFR1c. Des expériences ont été réalisées en triple exemplaire biologique avec des résultats similaires. C, superposition de la structure aux rayons X du complexe ternaire FGF23 – FGFR1c – αKlotho (PDB ID : 5W21, coloré en vert) sur la partie correspondante FGF23 – FGFR1cP – αKlotho dans la structure cryo-EM de 1: 2: 1: 1 Le complexe quaternaire FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS (coloré en rose) montre un haut degré de similarité (RM)D de 1,16 Å].

a, Lysats dénaturés de L6-FGFR1cWT, L6-FGFR1cK175Q/K177Q (FGFR1cΔHBS1), L6-FGFR1cK207Q/R209Q (FGFR1cΔHBS2) et L6-FGFR1cK175Q/K177Q/K207Q/R209Q (FGFR1cΔ Les cellules HBS1+2) ont été incubées avec l'endoglycosidase H (Endo H) ou Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F) ou non traité. Les échantillons ont été immunotransférés avec un anticorps spécifique à l'isoforme FGFR1c. Les données d'immunoblot ont été quantifiées comme décrit dans la section Méthodes et sont présentées sous forme de moyenne ± ET. b–d, Lysats dénaturés de lignées cellulaires L6 exprimant de manière stable FGFR1cWT, ses quatre mutants Site 2 (FGFR1cE249A, FGFR1cR254A, FGFR1cI256A, FGFR1cY280A) et un Site 1 (FGFR1cA170D/A171D/S219D) (b), FGFR3c de type sauvage ( FGFR3cWT) ou ses quatre mutants Site 2 (FGFR3cE247A, FGFR3cR252A, FGFR3cI254A, FGFR3cY278A) (c), FGFR4 sauvage (FGFR4WT) ou ses quatre mutants Site 2 (E243A, R248A, I250A, Y274A) (d) ont été traités avec Endo H, PNGase F ou non traité. Les échantillons ont été immunotransférés avec des anticorps spécifiques à l'isoforme FGFR comme indiqué. Des expériences ont été réalisées en triple exemplaire biologique avec des résultats similaires. La quantification a été effectuée comme décrit dans la section Méthodes et est présentée sous forme de valeurs moyennes ± SD P déterminées par ANOVA à un facteur suivi du test post hoc de comparaisons multiples de Tukey.

Données source

A, à gauche et au centre : représentations de dessins animés des composants FGF23-FGFRS et FGFRP-αKlotho du complexe quaternaire indiqués dans l'orientation obtenue via l'alignement des domaines D2 de FGFRS et FGFRP. À droite : superposition des composants FGF23-FGFRS et FGFRP-αKlotho via l'alignement des domaines D3 des récepteurs. Notez que l'extrémité N-terminale du FGF23 et l'αKlotho RBA engagent les rainures hydrophobes équivalentes dans D3 des chaînes FGFRS et FGFRP. b – d, l'extrémité N-terminale du FGF23 subit un changement conformationnel majeur dans les complexes quaternaires FGF23 – FGFR – αKlotho – HS. Dessin animé et représentation de surface (uniquement pour le composant FGF23) du complexe ternaire sans HS (c'est-à-dire la structure des rayons X) (b) et du complexe quaternaire induit par HS (c'est-à-dire les structures cryo-EM) (c) dans la même orientation obtenus via l'alignement de leurs chaînes FGF23. ( d ) Représentation en dessin animé d'une superposition entre FGF23-FGFR1c du complexe ternaire FGF23 – FGFR1c – αKlotho et FGF23-FGFR1cP du complexe quaternaire via l'alignement FGF23. Notez la différence spectaculaire dans les positions de l'extrémité N-terminale du FGF23 entre les deux structures. e, Densités électroniques de l'extrémité N-terminale du FGF23 dans les structures cryo-EM des complexes quaternaires FGF23 – FGFR1c – αKlotho – HS aux niveaux de contour indiqués. Notez que les densités d'électrons pour l'extrémité N-terminale du FGF23 sont faibles et inégales. f – i, les données de simulation MD montrent que l'extrémité N-terminale du FGF23 engage D3 de FGFR1cS. f, à gauche : représentation en dessin animé de la structure cryo-EM du complexe quaternaire FGF23-FGFR1c-αKlotho-HS. FGF23, FGFR1cP, FGFR1cS et αKlotho sont respectivement en orange, vert, cyan et bleu. Droite : vue agrandie de la région encadrée (à gauche) montrant la progression conformationnelle de la queue N-terminale de FGF23 (c'est-à-dire, Y25 à W36) et D3 de FGFR1cS dans une trajectoire de simulation MD de 300 ns indiquée par une transition de couleur à partir de la orange (0 ns) à bleu (300 ns) par intervalles de 60 ns. L'extrémité N-terminale du FGF23 interagit avec le feuillet à trois brins βC: βF: βG dans le domaine FGFR1cS D3. gh, Changements de RMSD (g) et Fluctuation quadratique moyenne (RMSF, h), respectivement, de la queue N-terminale du FGF23 pendant la simulation MD. Notez que la RMSD des résidus N-terminaux du FGF23 s'est stabilisée autour de 4 Å après 120 ns. Il est important de noter que les résidus aux extrémités distale et proximale de l'extrémité N-terminale du FGF23 présentaient respectivement le RMSF le plus grand et le plus petit, reflétant leurs densités d'électrons cryo-EM respectives (comparer e et h). i, Changements dans les distances de quatre paires de contacts sélectionnées (Y25 – L342S, S29 – R254S, L31 – A259S et L32 – I256S) entre les résidus N-terminaux de FGF23 et les résidus dans D3 de FGFR1cS. Les distances des paires de résidus hydrophobes Y25 – L342S, L31 – A259S et L32 – I256S ont fluctué autour de 5 Å, indiquant la formation de contacts hydrophobes entre ces paires de résidus. De même, la distance par paires pour S29-R254S a fluctué autour de 4 Å après 120 ns indiquant une liaison hydrogène entre les chaînes latérales de cette paire de résidus.

ab, Justification du test de complémentation des récepteurs. Centre : Représentation en dessin animé/surfacique du complexe quaternaire FGF23–FGFR1c–αKlotho–HS dans deux orientations liées par une rotation de 180° autour de l'axe Y. Les cercles indiquent les circonférences approximatives des sites de liaison de ligand dans les récepteurs primaires et secondaires sélectionnés pour la mutagenèse. a, Gauche : vue agrandie de la région encerclée sur le récepteur secondaire montrant que Ile-203 et Ser-223 de FGFR1cS s'engagent dans des contacts hydrophobes et de liaison hydrogène avec des résidus dans le noyau de FGF23. Droite : vue agrandie de la région encerclée sur le récepteur primaire montrant que Ala-167 et Val-248 de FGFR1cP s'engagent dans des contacts hydrophobes hautement conservés avec Tyr-124 et Leu-158 de FGF23, respectivement. De plus, Ala-167 crée également une liaison hydrogène avec Tyr-124. b, à gauche, vue agrandie de la région encerclée sur le récepteur primaire montrant que les Ile-203 et Ser-223 correspondants dans FGFR1cP sont exposés au solvant. Ainsi, une molécule FGFR1cI203E/S223E modifiée (c'est-à-dire FGFR1cΔSLBS) devrait conserver la capacité d'agir en tant que récepteur primaire malgré la perte de la capacité de fonctionner en tant que récepteur secondaire. À droite, vue agrandie de la région encerclée sur le récepteur secondaire montrant que les Ala-167 et Val-248 correspondants dans FGFR1cS ne jouent aucun rôle dans la formation du complexe quaternaire et sont exposés au solvant. Ainsi, un mutant FGFR1cA167D/V248D modifié (c'est-à-dire, FGFR1cΔPLBS) devrait perdre la capacité de fonctionner en tant que récepteur primaire mais pourrait toujours agir en tant que récepteur secondaire. c, Démonstration de la complémentation des récepteurs entre FGFR1cΔSLBS et FGFR1cΔPLBS et entre FGFR4ΔSLBS et FGFR1cΔPLBS via PLA. Des champs de microscopie fluorescente représentatifs de lignées cellulaires stables soumises à PLA sont présentés. Barre d'échelle, 10 μm. Les expériences ont été réalisées au moins deux fois la répétition biologique avec des résultats similaires. d, alignement de séquence basé sur la structure des régions de liaison de ligand (c'est-à-dire D2, lieur D2-D3 et D3) des sept isoformes de FGFR. À titre indicatif, une représentation schématique d'un FGFR prototypique est présentée et ses différents domaines sont étiquetés. La moitié C-terminale de D3 qui subit un épissage alternatif dans FGFR1-FGFR3 est surlignée en bleu foncé. Notez que la moitié N-terminale non épissée de D3 est conservée entre les isoformes b et c. Des éléments de structure secondaire sont fournis sur le dessus de l'alignement. Les résidus HS interagissant sont tous localisés dans le domaine D2 et sont colorés en magenta. Les résidus médiant les interfaces FGF23-FGFRP et αKlotho-FGFRP sont colorés respectivement en jaune et en vert. Notez que les résidus médiant les contacts directs FGFRP-FGFRS (en bleu clair) sont entièrement conservés parmi les sept isoformes. Quant à l'interface FGF23-FGFRS (en orange), seuls les résidus D2 qui entrent en contact avec le noyau de FGF23 sont conservés entre les sept isoformes. Cependant, deux résidus D3 hydrophobes qui interagissent avec l'extrémité N-terminale du FGF23 à l'interface FGF23-FGFRS ne sont conservés que dans FGFR1c-3c et FGFR4 (indiqués par des têtes de flèches noires). Dans FGFR1b-3b, ces résidus, qui chevauchent le site de liaison pour RBA de αKlotho, sont remplacés par des résidus chargés. L'hydrophobicité du sillon D3 FGFR1b-3b est en outre perturbée par la présence d'un site de glycosylation N-lié unique dans leurs sillons D3 (indiqué par une boîte rouge). Dans FGFR2c, un résidu hydrophobe clé conservé est remplacé par un Lys-296 chargé (souligné en rouge) qui explique probablement l'incapacité de FGFR2c à se lier à αKlotho.

a, Immunoblots d'extraits de cellules entières de lignées cellulaires L6 non traitées ou traitées au FGF (1 nM) non transfectées et transfectées exprimant de manière stable FGFR1cWT, FGFR1cE249A, FGFR1cR254A, FGFR1cI256A ou FGFR1cY280A sondés avec des anticorps contre FGFR phosphorylé, PLCγ1 et FRS2α. b, Immunoblots d'extraits de cellules entières de lignées cellulaires L6 non traitées ou traitées au FGF (1 nM pour FGF1 et 2 nM pour FGF3/7/10/22) traitées et transfectées exprimant de manière stable FGFR2bWT, FGFR2bE250A, FGFR2bR255A, FGFR2bI257A ou FGFR2bY281A sondé avec Anticorps spécifique à l'isoforme FGFR2b (en haut) ou anticorps phosphospécifiques comme dans le panneau a. Des expériences ont été réalisées en triple exemplaire biologique avec des résultats similaires.

a, Schéma de principe montrant qu'en réponse à la paracrine FGF1/3/7/10 et HS, FGFR2bΔSLBS et FGFR2bΔPLBS peuvent se compléter et former des complexes de signalisation asymétriques 1:1:1:1 FGF-FGFR2bΔSLBS-FGFR2bΔPLBS-HS. be, Démonstration de la complémentation des récepteurs entre FGFR2bΔSLBS et FGFR2bΔPLBS via westernblot. Les lignées cellulaires L6 exprimant individuellement FGFR2bWT, FGFR2bΔPLBS, FGFR2bΔSLBS ou co-exprimant FGFR2bΔSLBS avec FGFR2bΔPLBS ont été traitées avec 1 nM FGF1 (b), 2 nM FGF3 (c), 2 nM FGF7 (d) ou 2 nM FGF10 (e) pour intervalles de temps croissants, et les extraits cellulaires totaux ont été immunotransférés comme indiqué. Des expériences ont été réalisées en triple exemplaire biologique avec des résultats similaires.

a, Diagramme schématique montrant que FGF1 ou FGF10, HS et FGFR1bΔSLBS (servant de récepteur primaire) forment des complexes stables qui recrutent ensuite FGFR2bΔPLBS comme récepteur secondaire. bc, les lignées cellulaires L6 exprimant individuellement FGFR1bWT ou FGFR1bΔSLBS, ou co-exprimant FGFR1bΔSLBS + FGFR2bΔPLBS ont été traitées avec 1 nM FGF1 (b) ou 2 nM FGF10 (c) pendant des intervalles de temps croissants et les extraits cellulaires ont été immunotransférés. d, Diagramme schématique montrant qu'en présence de HS, FGF3 et FGFR2bΔSLBS (servant de récepteur primaire) forment un complexe stable et recrutent ensuite FGFR3bWT comme récepteur secondaire. e, les lignées cellulaires L6 exprimant FGFR3bWT seul ou co-exprimant avec FGFR2bΔSLBS ont été traitées avec 2 nM de FGF3 pendant des intervalles de temps croissants et les extraits cellulaires ont été immunotransférés. Des expériences ont été réalisées en triple exemplaire biologique avec des résultats similaires.

a, En raison de la faible affinité de liaison HS de l'hormone FGF, HS seul est incapable de stabiliser le complexe endocrinien FGF-FGFR et d'induire une dimérisation/activation asymétrique soutenue des récepteurs. Le flou et l'association lâche sont utilisés pour souligner la nature instable/transitoire du complexe ternaire putatif FGF-FGFR-HS et la dimérisation/activation des récepteurs physiologiquement sans conséquence. b, le co-récepteur Klotho lié à la membrane engage simultanément le domaine D3 du FGFR et la queue C-terminale du FGF, stabilisant ainsi le complexe endocrinien FGF-FGFR dans un complexe ternaire. Ce faisant, le co-récepteur Klotho compense efficacement l'incompétence de HS dans la stabilisation du complexe FGF-FGFR endocrine binaire. HS est maintenant en mesure de recruter un deuxième FGFR au complexe binaire stabilisé induisant ainsi une dimérisation asymétrique. Néanmoins, en raison de la faible affinité de liaison HS de l'hormone FGF, les dimères endocriniens 1: 2 FGF-FGFR induits par Klotho et HS sont toujours inférieurs aux dimères paracrine 1: 2 FGF-FGFR induits par HS en termes de longévité / stabilité (indiqué par un léger flou de FGFRS en b). c, En raison de leurs affinités de liaison élevées au HS, les FGF paracrines peuvent compter sur le HS comme seul co-récepteur pour se lier de manière stable au FGFR primaire et recruter un FGFR secondaire, induisant ainsi la formation de dimères de récepteurs asymétriques rigides et à longue durée de vie.

Fig. supplémentaires. 1–4 et Tableaux 1–2.

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Réimpressions et autorisations

Chen, L., Fu, L., Sun, J. et al. Base structurelle de la signalisation hormonale FGF. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06155-9

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Reçu : 06 septembre 2022

Accepté : 02 mai 2023

Publié: 07 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-023-06155-9

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